Erste molekulare Daten zum menschlichen Spulwurm-Artenkomplex Ascaris lumbricoides aus der Bronze- und Eisenzeit in Hallstatt, Österreich

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12055 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Paläoparasitologische Untersuchungen können wertvolle Informationen über die Entstehung, Verbreitung und Beseitigung von Parasiten in einem bestimmten Zeitraum in der Vergangenheit liefern. In den prähistorischen Salzbergwerken von Hallstatt in den österreichischen Alpen wurden menschliche Fäkalien in Salz konserviert. Ziel dieser Studie war es, alte DNA von Darmparasiten aus diesen Koprolithen zu gewinnen. Insgesamt wurden 35 Koprolithen aus den Hallstatt-Salzbergwerken aus der bronzezeitlichen Bergbauphase (1158–1063 v. Chr.) bzw. der eisenzeitlichen Bergbauphase (750–662 v. Chr.) mikroskopisch und mit molekularen Methoden analysiert. In 91 % der Koprolithproben wurden lichtmikroskopisch Eier von bodenübertragenden Helminthen (STH), insbesondere von Trichuris und/oder Ascaris, nachgewiesen. Die Ascaris-Eier waren außergewöhnlich gut erhalten. Für die weitere Analyse wurde DNA aus den paläofäkalen Proben extrahiert und artspezifische Primer entwickelt, die auf verschiedene Gene abzielen. Während die Amplifikation der Trichuris-DNA erfolglos blieb, wurden Sequenzdaten des A. lumbricoides-Artenkomplexes erfolgreich von 16 Koprolithen aus drei verschiedenen Genen erhalten, dem mitochondrialen Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit-1-Gen (cox1), dem mitochondrialen Cytochrom-B-Gen (cytB) und dem mitochondrialen Gen NADH-Dehydrogenase-Untereinheit-1-Gen (nadh1). Wichtig ist, dass dazu zwei Ascaris-Sequenzen aus einem Koprolithen aus der Bronzezeit gehörten, bei denen es sich nach unserem besten Wissen um die ersten molekularen Daten dieser Gattung aus dieser Zeit handelt.

Hallstatt ist ein kleines Dorf idyllisch am gleichnamigen See in den östlichen österreichischen Alpen gelegen und eine der bedeutendsten archäologischen Stätten der Alten Welt, da es Typusstätte der frühen europäischen Eisenzeit, der Hallstattzeit, ist. Die Region gehört zum UNESCO-Weltkulturerbe und beherbergt eines der ältesten bekannten Salzbergwerke der Welt. Seit dem 14. Jahrhundert ist hier ein großflächiger Salzabbau unter Tage nachweisbar. BCE (Bronzezeit). Weltweit sind nur vier prähistorische Salzminen bekannt – zwei davon in Österreich, in Hallstatt und Dürrnberg, das dritte in Chehrabad im Nordwesten Irans und das vierte in Duzdağı in Aserbaidschan1.

Die Paläoparasitologie ist eine vergleichsweise junge Disziplin, die die Rekonstruktion der geografischen Verteilung von Parasiten und ihren Wirten im Laufe der Zeit ermöglicht und dabei Daten über Wanderungen alter Populationen, Domestizierung von Tieren, kulturelle Gewohnheiten, Hygiene, medizinische Praktiken und andere Aspekte des Lebens wie Hygiene und Hygiene liefert Abfallmanagement2. Der Pionier der Paläoparasitologie, Sir Marc Armand Ruffer, entdeckte verkalkte Eier des Blutegels Schistosoma haematobium in den Nieren zweier ägyptischer Mumien aus der Zeit zwischen 1250 und 1100 v. Chr.3. Im Jahr 1944 berichtete Szidat über den Nachweis von Eiern von Trichuris trichiura, dem menschlichen Peitschenwurm, und Ascaris lumbricoides, dem menschlichen Spulwurm, in einer Moormumie aus dem damaligen Ostpreußen4 und 1960 veröffentlichten Callen und Cameron eine Methode zur Rehydrierung von ausgetrockneten Tieren antikes Material mit 0,5 % wässriger Trinatriumphosphatlösung5. Mit dieser Methode wurde es möglich, Parasiten auch aus alten Fäkalien (Koprolithen) zu untersuchen. In Österreich wurden die ersten paläoparasitologischen Studien Anfang der 1970er Jahre an Koprolithen aus den alten Salzbergwerken in Hallstatt und Dürrnberg durchgeführt und dabei über die Funde von Eiern von T. trichiura und A. lumbricoides berichtet6.

Das Ziel dieser Studie war die Gewinnung alter DNA von Darmwürmern aus Koprolithen verschiedener Zeiträume aus den alten Salzbergwerken von Hallstatt. Die in den Abbaugebieten ausgegrabenen großen organischen Bestände (z. B. Werkzeuge, Arbeitsmaterialien) sind gut erforscht (Technologie, Materialanalytik)7, molekulare Daten sind jedoch noch rar und eröffnen großes Potenzial. Für die aktuelle Studie wurden Koprolithen unter sterilen Bedingungen an verschiedenen Standorten innerhalb der Abbaugebiete für unterschiedliche Zeiträume gewonnen und mit archiviertem Material verglichen. Neuartige Primer wurden entwickelt, um kurze Fragmente von drei mitochondrialen Markergenen zur Identifizierung zu amplifizieren. Da alte DNA normalerweise nur in extrem geringen Konzentrationen verfügbar ist8, wurden mitochondriale Marker als PCR-Ziele ausgewählt, wobei mitochondriale DNA (mtDNA) in viel höheren Kopienzahlen als genomische DNA vorhanden ist.

Die in diese Studie einbezogenen Probenahmestellen waren der spätbronzezeitliche Bergbaustollen im heutigen „Christian von Tuschwerk“ sowie die früheisenzeitlichen Fundstellen „Kernverwässerungswerk“, „Kübeck“ und „Josef Ritschner Werk“ (Abb . 1). Die Standorte der bronzezeitlichen Bergbaugebiete sowie der früheisenzeitlichen Bergbaugebiete liegen mehr als 100 m unter der Erde. Die Produktionsrückstände des prähistorischen Bergbaus, wie Abraumgestein, Salzreste, verbrannte Fackeln und zerbrochene Werkzeuge, sowie die Exkremente der Bergleute verblieben in den Bergwerken und bildeten dicke Abfallschichten. Nach der Aufgabe der Mine schloss der Gebirgsdruck alle prähistorischen Bergbaukammern wieder, schloss alle zurückgebliebenen Materialien ein und verdichtete die Schuttschichten zu steinähnlicher Härte. Aufgrund der hohen Salzkonzentration blieben organische Gegenstände über die Jahrtausende hinweg perfekt erhalten7,9. Das Naturhistorische Museum Wien führt seit den 1960er Jahren Ausgrabungen in den prähistorischen Bergbauanlagen durch. Die Bergbauphasen wurden mithilfe der Dendrochronologie datiert: Die spätbronzezeitliche Fundstelle „Christian von Tuschwerk“ datiert auf (1158–1063 v. Chr.) und die oben erwähnten früheisenzeitlichen Fundstellen auf (750–662 v. Chr.)10. Die Koprolithen (Abb. 2) sind im Bergbauschutt eingebettet und an verschiedenen Standorten zu finden. Temperatur und Luftfeuchtigkeit sind das ganze Jahr über relativ konstant und es gibt kein natürliches Licht.

Querschnitt zur Verteilung prähistorischer Bergbaustandorte im Salzbergwerk Hallstatt. Grün – Bronzezeit, Blau – späte Eisenzeit, Rot – frühe Eisenzeit. 15 – Standort Kübeck (Aufdeckungsschlag), 5 – Standort Josef Ritschner Werk (Sinkwerksebentel), 2 – Standort Kernverwässerungswerk, 8 – Standort Christian von Tuschwerk (D. Brandner/NHM Wien). Kleines Fenster: Karte mit der Lage des Standortes innerhalb Österreichs und Europas (erstellt von Julia Klammer).

Im Boden eingebettete Koprolithen. Koprolithen unterscheiden sich vom umgebenden Material durch ihre bräunliche Farbe und ihre amorphe Textur. (A) archivierte Koprolithen. (B) frische Koprolithen an der Probenahmestelle. (C) Probenahme nach Entfernung der Oberflächenschichten.

Insgesamt wurden in dieser Studie 35 Koprolithproben aus dem antiken Salzbergwerk Hallstatt analysiert. Vier Proben stammten aus der späten Bronzezeit (12. bis 11. Jahrhundert v. Chr.) und 31 Proben aus der frühen Eisenzeit (8. bis 5. Jahrhundert v. Chr.). Die Proben wurden an fünf verschiedenen Daten im Abstand von mehreren Jahren gesammelt (1989, 1993, 2003, 2015, 2018 und 2019). 26 Proben stammten aus der Sammlung des Naturhistorischen Museums Wien (Abb. 2A), vier Proben wurden 2018 für eine frühere Studie zu Koprolithen aus dem Salzbergwerk Hallstatt11 gesammelt und fünf weitere Proben wurden 2019 für diese Studie gesammelt (Abb. 2B,C). Diese neun Proben wurden unter sterilen Bedingungen gesammelt. Zuerst wurde die äußerste Schicht mit einem sterilen Skalpell abgekratzt und dann wurde das alte Fäkalienmaterial mit einem frischen sterilen Skalpell unter Verwendung von doppelt sterilen Einweghandschuhen und einer FFP2-Maske direkt in ein steriles Röhrchen entnommen. Während des Transports wurden die Proben gekühlt. Im Labor wurden die Proben unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Air-Flow-Schrank (Heraeus HERAsafe® HSP12, Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau, Deutschland) verarbeitet.

Alle Proben wurden in einzelnen, etikettierten Kunststoffbehältern gelagert und unter sterilen Bedingungen geöffnet und verarbeitet. Die Farbe der Koprolithen reichte von gräulich-hellbraun bis dunkelbraun (Abb. 2). Die Proben aus der Museumssammlung waren dehydriert, die Proben aus den Jahren 2018 und 2019 waren feucht und hatten eine weiche, tonartige Textur.

Alle Proben wurden mikroskopisch untersucht. Zu diesem Zweck haben wir mehrere Protokolle aus der Literatur ausprobiert und verglichen12,13,14,15 und ein modifiziertes Protokoll erstellt. Kurz gesagt, Aliquots von etwa 30 mg jeder Probe wurden in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und in 0,5 ml 10 %iger NaOH bei Raumtemperatur durch leichtes Schütteln auf einer Schaukelplattform über Nacht rehydriert. Am folgenden Tag wurden die Proben gevortext und 40 μl jeder Suspension auf einen Objektträger gegeben und lichtmikroskopisch mit einem Nikon Eclipse E800-Mikroskop (Nikon Instruments Inc., USA) untersucht. Drei Objektträger pro Probe wurden analysiert. Mit einer Mikroskopkamera (Nikon DS-Fi2, Nikon Metrology, Deutschland) wurden mikroskopische Aufnahmen gemacht und die Eizahl wie zuvor beschrieben geschätzt6,15. Rehydrierte Proben wurden bei 4 °C gelagert.

Um nachzuweisen, dass die mikroskopisch nachgewiesenen Eier noch DNA enthielten, wurden aus Proben mit intakten, gut konservierten Eiern einzelne Eier isoliert. Dazu wurde ein Tropfen von 100 μl dH2O zentral in eine sterile Petrischale gegeben und 25 μl der jeweiligen Probe hinzugefügt und mit dem Wasser vermischt. Einzelne Eier wurden mit einer Mikropipette (Volumen 5–10 μl) unter Verwendung eines Umkehrmikroskops (Nikon TMS, Nikon Instruments Inc., USA) isoliert. Einzelne Eier wurden zur DNA-Extraktion mit dem DNeasy® PowerSoil® Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) wie unten beschrieben einzeln in 1,5-ml-Röhrchen mit 50 μl 70 % Ethanol überführt.

Insgesamt wurden 33 Proben für die molekulare Analyse ausgewählt, von zwei davon hatten wir auch einzelne Eier. Da bekannt ist, dass die Ausbeute an aDNA je nach Extraktionsprotokoll erheblich variieren kann16, wurden vier verschiedene DNA-Extraktionsmethoden bewertet und verglichen, darunter das QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland), das QIAamp® DNA Stool Kit ( QIAGEN, Hilden, Deutschland), das GeneClean® Kit für alte DNA (MP Biomedicals, USA) und das DNeasy® PowerSoil® Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland). Letzteres wurde speziell zur Entfernung von Inhibitoren entwickelt, die häufig in Boden- und Umweltproben vorkommen, lieferte die höchsten DNA-Ausbeuten und wurde daher für alle Proben verwendet. Kurz gesagt, etwa 30 mg rehydratisierte Koprolithproben wurden mit einem Precellys® 24-Homogenisator (Bertin Instruments, Frankreich) verarbeitet. Hier wurden die besten Ergebnisse mit 0,7-mm-Granatperlen erzielt (im Vergleich zu 0,5-mm-Glasperlen, 0,1-mm-Zirkonium-Keramikoxidperlen und einer Mischung aus beiden). Um so viel NaOH wie möglich zu entfernen, wurden die Proben dreimal gewaschen, indem die Proben mit den Perlen in ein frisches Röhrchen überführt, 400 μl steriles ddH2O zugegeben, leicht gevortext und bei 20.000 × g/5 Min. zentrifugiert wurden. Nach dem Waschen wurde so viel Flüssigkeit wie möglich entfernt, das Pellet in 200 µl sterilem ddH2O resuspendiert und zusammen mit den Perlen zurück in die PowerBead-Röhrchen überführt. Die Proben wurden vorsichtig gevortext und dann auf die gleiche Weise wie die Röhrchen mit den einzelnen Eiern verarbeitet, indem 60 μl Lösung C1 (DNeasy® PowerSoil® Kit) hinzugefügt und die Proben mehrmals umgedreht wurden. Anschließend wurden die Proben 15 s lang drei Homogenisierungszyklen bei 5.800 U/min mit 60 s Pause dazwischen unterzogen und über Nacht bei 56 °C und 400 U/min inkubiert. Nach dem Vortexen und Zentrifugieren bei 10.000 × g/30 s wurden die Überstände in saubere 2-ml-Sammelröhrchen überführt und gemäß den Anweisungen des Herstellers gewaschen. Die DNA wurde je nach Anzahl der Eier in der Probe in 20–30 μl Elutionspuffer eluiert und bei −20 °C gelagert. Die mit einem NanoDrop™-Spektrophotometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, USA) gemessenen Gesamt-DNA-Ausbeuten lagen zwischen etwa 50 und 500 ng/μl und waren in den frisch gewonnenen, nicht dehydrierten Proben am höchsten, wie bereits in einer früheren Studie gezeigt11.

Mehrere Primer aus der Literatur, firmeneigene Primer und Primer aus einer früheren Studie11 wurden getestet und verglichen. Allerdings ergab keines dieser Primerpaare in den jeweiligen PCRs ein Amplikon mit der richtigen Größe. Daher wurden neue Primer für jede Art (Tabellen 1 und 2) basierend auf Referenzsequenzen aus der NCBI-Datenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) und unter Verwendung von GeneDoc (National Resource for Biomedical Supercomputing, Pittsburgh, USA), ClustalX (Conway Institute, Dublin, Irland) und OligoCalc (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html). Die Primer wurden entwickelt, um kurze Sequenzen mit einer Länge zwischen 97 und 246 Basenpaaren (bp) zu amplifizieren, da alte DNA normalerweise stark fragmentiert ist.

Für Ascaris wurden vier spezifische Primerpaare entworfen, darunter zwei Primerpaare, die auf das Gen der mitochondrialen Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit 1 (cox1) mit überlappenden Amplifikaten abzielen. Das erste Primerpaar wurde gegenüber der Literatur (ACF2 und ACR2)12 leicht modifiziert und flankiert ein etwa 182 bp langes Fragment, das zweite Primerpaar amplifiziert ein etwa 172 bp langes Fragment. Das dritte Primerpaar zielt auf eine ~ 193 bp große Region innerhalb des mitochondrialen NADH-Dehydrogenase-Untereinheit-1-Gens (nadh1) und das vierte Primerpaar zielt auf das mitochondriale Cytochrom-B-Gen ab und führt zu einem ~ 138 bp großen Amplifikat.

Alle Amplifikationen wurden in Reaktionsvolumina von 50 μl durchgeführt und in unabhängigen Aufbauten mit unterschiedlichen DNA-Konzentrationen und unter Verwendung einer Hot FIREPol DNA-Polymerase (5 U/μl, Solis BioDyne, Tartu, Estland) getestet. Alle PCRs wurden in einem Thermocycler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) durchgeführt, beginnend mit einem ersten Denaturierungsschritt (Heißstart) bei 95 °C für 15 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen von 1 Minute bei 95 °C, 45–50 Sekunden zwischen 52 und 52 Sekunden und 54 °C je nach Grundierung und 50 s bei 72 °C mit einem abschließenden Elongationsschritt bei 72 °C für 7 min. Die Zyklusbedingungen für alle Primerpaare sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben. Die PCR-Ergebnisse wurden durch Agarosegelelektrophorese unter Verwendung eines Transilluminators (Gel Doc XR +, Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornien, USA) sichtbar gemacht. Die Amplifikate wurden zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.

Alle Bänder geeigneter Größe wurden mit einem sterilen Skalpell aus den Gelen herausgeschnitten. Die DNA wurde aus den Banden mit dem GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Cytiva Europe GmbH, Wien, Österreich) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die DNA wurde je nach Intensität der Banden in 10–50 μl Elutionspuffer eluiert. Gereinigte DNA wurde bei –20 °C gelagert. Sequenzen wurden von beiden Strängen in mindestens zwei unabhängigen Aufbauten unter Verwendung des BigDyeTM Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit und eines automatisierten Sequenzierers SeqStudio (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, Waltham, USA) erhalten. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit GeneDoc und Chromas (Technelysium Pty Ltd., Australien) zu Konsensussequenzen zusammengesetzt und mit ClustalX mit Referenzsequenzen verglichen. Für die weitere Datenanalyse wurde MEGA-X (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, Pennsylvania State University, USA) verwendet.

Insgesamt wurden 35 Koprolithproben, vier aus der Bronzezeit und 31 Proben aus der Eisenzeit, nach der Rehydrierung mikroskopisch analysiert. Von diesen 35 Proben waren 32 (91 %) positiv auf Eier von Darmwürmern (Abb. 3). Am häufigsten wurden Eier von Trichuris nachgewiesen, nämlich in 31 Proben. Davon enthielten 14 Proben nur Eier von Trichuris und 17 Proben zusätzlich Eier von Ascaris. Eine Probe enthielt nur Eier von Ascaris. Wurmeier wurden in drei der vier Koprolithen aus der Bronzezeit nachgewiesen, wobei zwei Proben (Proben-IDs: 3.4041 und 2019/1) nur Eier von Trichuris und eine Probe (ID: 18.215) Eier von Trichuris und Ascaris enthielten. Wie bereits in früheren mikroskopischen Untersuchungen an Koprolithen dieser Standorte beschrieben6, waren die Eidichten mit bis zu ~ 7000 Eiern/g vergleichsweise hoch. Im Vergleich zu Trichuris-Eiern waren Ascaris-Eier außergewöhnlich gut konserviert (siehe auch ergänzende Abbildung 1).

Mikroskopische Aufnahmen von Wurmeiern aus Koprolithen. (A) Ascaris-Ei aus einer Probe aus der Bronzezeit. (B) Trichuris-Ei aus einer Probe aus der Eisenzeit mit Schäden an der Eierschale. Interferenzkontrastmikroskopie, Vergrößerung: 400 ×.

Da es nur aufgrund der Morphologie nicht möglich ist, zwischen Eiern von Trichuris trichiura und T. suis bzw. zwischen Ascaris lumbricoides und A. suum zu unterscheiden, beziehen wir uns hier auf Trichuris-Eier und Ascaris-Eier.

In keiner der Proben wurden Eier anderer Helminthen nachgewiesen.

Spezifische PCRs wurden mit allen 18 Proben durchgeführt, die mikroskopisch positiv für Ascaris waren (von zwei davon hatten wir auch einzelne Eier), und mit 10 Proben, die mikroskopisch positiv für Trichuris waren (siehe auch Ergänzungstabelle 1). Aus 16 Ascaris-Proben, darunter eine Probe auch als einzelnes Ei, wurden Amplifikate mit der richtigen Länge erhalten; in einigen Fällen konnten Fragmente von mehr als einem Gen erfolgreich gewonnen werden. Von den Trichuris-Proben ergaben drei Amplifikate, allerdings nicht in der richtigen Größe. Für alle anderen Trichuris-Proben wurden keine Banden gefunden. Alle sichtbaren PCR-Produkte wurden zur DNA-Sequenzierung aus den jeweiligen Gelen herausgeschnitten.

Insgesamt führten 31 PCR-Läufe zu Amplikons mit der richtigen Länge. Amplikons der Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit 1 (cox1) wurden aus 15 Proben, Cytochrom-B-Amplifikate (cytB) aus neun Proben und Amplikons der NADH-Dehydrogenase-Untereinheit 1 (nadh1) aus sieben Proben erhalten. Alle Amplikons wurden einer Sanger-Sequenzierung unterzogen. Zuverlässige Sequenzen wurden aus 29 Amplikons erhalten, darunter 15 cox1-, acht cytB- und sechs nadh1-Sequenzen. Von den cox1-Sequenzen waren 11 Proben von hoher Qualität und aus beiden Strängen wurden Konsensussequenzen generiert. Die Sequenzen der verbleibenden vier PCR-Amplikons waren zu kurz und/oder hatten zu viele mehrdeutige Basen und wurden daher von weiteren Analysen ausgeschlossen. Die erhaltenen cox1-Konsensussequenzen haben eine Länge von 142 bp. Die Sequenzidentitäten reichten von 129 bis 141/142 bp (92,81 % bis 99,30 %). Von den acht CytB-Sequenzen ergaben fünf zuverlässige Konsensussequenzen mit einer Länge von 97 bp und Identitäten im Bereich von 90 bis 96/97 bp (93,75 % bis 98,97 %). Nadh1-Sequenzen wurden aus sechs Proben erhalten, von denen fünf von guter Qualität waren. Die erhaltenen Konsensussequenzen hatten eine Länge von 152 bp und die Sequenzidentitäten lagen im Bereich von 136 bis 148/152 bp (90,67–98,00 %). Für sechs Proben wurden Sequenzen von mindestens zwei verschiedenen Genen gewonnen. Mit diesen Fragmenten wurden die Proben zuverlässig als A. lumbricoides-Artenkomplex identifiziert. Diejenigen mit der höchsten Anzahl eindeutiger Basen zeigten die höchste Identität zur A. lumbricoides-Artenkomplex-Klade A und die niedrigste Identität zur Klade C.

Diese Studie liefert die ersten beiden antiken DNA-Sequenzen des Darmparasiten-Artenkomplexes A. lumbricoides aus der Bronzezeit. Darüber hinaus wurden mehrere Sequenzen verschiedener Gene des A. lumbricoides-Artenkomplexes von Koprolithen aus der Eisenzeit erhalten. Diese Studie ergab eine hohe Nachweishäufigkeit von bodenübertragenen Darmwürmern in den Koprolithen der Hallstätter Bergleute der Bronze- und Eisenzeit, es wurden jedoch nur Eier von Trichuris und Ascaris gefunden.

Insgesamt zeigten 91 % (32/35) der untersuchten paläofäkalen Proben Eier von Darmwürmern, darunter Trichuris sp. am häufigsten vorkommend, nachgewiesen in 31 Proben. Vierzehn Proben enthielten auch Eier von Ascaris sp. und eine Probe enthielt nur Ascaris-Eier. Wichtig ist, dass Eier beider Gattungen in Koprolithen sowohl aus der Bronze- als auch aus der Eisenzeit nachgewiesen wurden. Somit lässt sich anhand der aktuellen archäologischen Datierung der Probestellen10 mit Sicherheit sagen, dass die Hallstätter Bergleute zumindest im Zeitraum zwischen 1.158 und 662 v. Chr. von Peitschenwürmern und Spulwürmern befallen waren. Die tatsächliche Parasitenbelastung der prähistorischen Bergleute oder noch mehr der allgemeinen Bevölkerung von Hallstatt ist schwer abzuschätzen, unsere Ergebnisse und auch die früherer Studien6,11 deuten jedoch darauf hin, dass beide Helminthen zu dieser Zeit recht häufig vorkamen. Ein leichter Befall mit diesen Würmern verursacht in der Regel keine Symptome, Menschen mit starkem Befall oder Kinder können jedoch unter Bauchschmerzen, Durchfall und selten auch schwerwiegenderen Symptomen leiden. Da die Würmer vergleichsweise groß sind und nach ihrem Tod ausgeschieden werden, kann davon ausgegangen werden, dass die Bergleute von ihnen wussten. In den Minen wurden konservierte Blätter der Pestwurz (Petasites officinalis und Petasites paradoxus) gefunden, die noch heute in der Volksmedizin zur Behandlung von Bauchschmerzen eingesetzt werden17. Bei beiden Wurmarten handelt es sich um bodenübertragende Helminthen (STH) ohne Zwischenwirt, bei denen es sich um erwachsene weibliche Würmer handelt, die täglich Tausende von Eiern produzieren, die mit dem menschlichen Stuhl ausgeschieden werden. Die Eier müssen im Boden zu infektiösen Eiern heranreifen, die dann über kontaminierte Hände oder Nahrungsmittel vom nächsten menschlichen Wirt oral aufgenommen werden. Abhängig von den äußeren Bedingungen dauert es etwa 3–6 Wochen, bis die Eier infektiös werden. Das Auftreten von Spulwürmern und Peitschenwürmern ist ein Hinweis auf mangelnde Hygiene und Hygiene18. In Hallstatt waren insbesondere in der Eisenzeit die hygienischen Bedingungen in den Bergwerken offensichtlich schlecht, da Kochen, Essen und Stuhlgang an denselben Orten stattfanden. Dies wird durch die Tatsache bestätigt, dass Paläofeces überall in den Salzminen verteilt zu finden sind6,7,10,11,19. Bisher wurde in den Abbaugebieten nur ein einziger größerer Paläofäkalienhaufen gefunden, und zwar am Standort „Kernverwässerungswerk“, was auf eine mehrfache Nutzung dieser Stelle hindeuten könnte. In den Minen herrscht eine konstante Temperatur von 8 °C und eine vergleichsweise hohe Luftfeuchtigkeit, und prähistorische Bergleute arbeiteten in Arbeitsgruppen eng zusammen7,10,19, sodass die Bedingungen für das Überleben und die Übertragung von Wurmeiern günstig waren. Ascaris und Trichuris gehören zu den häufigsten Helminthen, die in paläoparasitologischen Proben gefunden werden, und zusammen mit den Hakenwürmern sind sie auch heute noch die häufigsten Helminthen beim Menschen, obwohl sie in den meisten Teilen Europas, einschließlich Österreich, nicht mehr endemisch sind. Weltweit sind etwa 807–1.121 Millionen Menschen mit Ascaris und etwa 604–795 Millionen mit Trichuris20 infiziert. Eier von T. trichiura wurden auch in Darmproben der berühmten gefrorenen Mumie „Mann aus dem Eis“ aus den Ötztaler Alpen aus der 1. Hälfte des 4. Jahrtausends nachgewiesen. BC21,22. Interessanterweise wurden in dieser Studie keine Eier anderer Darmwürmer gefunden, insbesondere keine Eier von Parasiten, die mit dem Verzehr von Fleisch oder Fisch in Zusammenhang stehen. In einer früheren Studie zu Koprolithen aus diesem Salzbergwerk11 wurden Strukturen gefunden, die Eiern von Taenia sp. ähneln. und Dibothriocephalus latus (= Diphyllobothrium latum) wurden gefunden, konnten aber nicht sicher identifiziert werden. Im anderen prähistorischen österreichischen Salzbergwerk, das sich in Dürrnberg (Salzburg), rund 60 km von Hallstatt entfernt, befindet, wurden Eier von Fasciola hepatica, Dicrocoelium dendriticum und Taenia sp. wurden zusammen mit Eiern von Ascaris und Trichuris in Koprolithen gefunden6,19,23. Die Bandwürmer Taenia spp. und D. latus werden über befallenes Schweine-/Rindfleisch bzw. Fisch übertragen, wenn sie roh oder unzureichend gegart verzehrt werden. Archäologische und archäozoologische Untersuchungen legen nahe, dass bereits in der Bronzezeit nicht nur die Salzproduktion, sondern auch die Verarbeitung und Konservierung von Fleisch (hauptsächlich Schweinefleisch) ein wichtiger Wirtschaftszweig in Hallstatt war7,24. Geschlachtete und geschnittene Fleischteile wurden an die Bergbaugemeinde geliefert und in großen Holzbecken mit salzhaltigem Bergbauschutt gepökelt. Darüber hinaus belegen archäozoologische und molekulare Analysen, dass Fleisch von verschiedenen Tieren (Schwein, Ziege, Rind und Hammelfleisch) verzehrt wurde25,26. Frühere Studien zu Paläofäces und die Untersuchung antiker Kochutensilien haben ergeben, dass die Bergleute der Eisenzeit typischerweise einen Eintopf verzehrten, der hauptsächlich aus Hirse, Gerste, Bohnen und Fleisch bestand und viele Stunden lang gekocht wurde27. Es gibt jedoch auch molekulare Beweise für eine erhebliche Komplexität der Ernährung der prähistorischen Bergleute, einschließlich des Verzehrs fermentierter Lebensmittel (Blauschimmelkäse) und Getränke (Bier) in der Eisenzeit26.

In dieser Studie wurden insgesamt 19 A. lumbricoides-Spezies-Komplex-spezifische Sequenzen aus verschiedenen Genen erfolgreich amplifiziert und sequenziert. Dies ist das erste Mal, dass antike Ascaris-DNA aus Koprolithen aus der Bronzezeit in Österreich geborgen wurde. In einer früheren Studie wurde antike Ascaris-DNA durch PCR nachgewiesen, es wurden jedoch keine zuverlässigen Sequenzdaten erhalten11. Bemerkenswert ist, dass in der aktuellen Studie nur DNA von Ascaris erfolgreich amplifiziert wurde, während die DNA von Trichuris weder aus der Bronzezeit noch aus der Eisenzeit erfolgreich amplifiziert wurde. Alle PCRs mit Trichuris-spezifischen Primern, die auf verschiedene Gene abzielten, waren erfolglos. Die molekulare Analyse von antikem Material ist eine Herausforderung, da die Geschwindigkeit des DNA-Abbaus von verschiedenen externen und internen Faktoren abhängt28. Wir nehmen an, dass die speziell dickwandigen Ascaris-Eier die DNA besser schützten als die verstopften Trichuris-Eier. Morphologisch gesehen wiesen die Trichuris-Eier größere Schäden auf als die Ascaris-Eier, und die meisten Eier hatten die Polpfropfen verloren, sodass der innere Inhalt vollständig dem Salz ausgesetzt war. In anderen archäologischen Stätten (allerdings ohne hohen Salzgehalt) wurde aDNA von Parasiten auch dann nachgewiesen, wenn keine mikroskopisch sichtbaren parasitären Strukturen vorhanden waren29,30.

Zwei aDNA-Fragmente des A. lumbricoides-Artenkomplexes wurden aus einem Koprolithen aus der Bronzezeit zwischen 1158 und 1063 v. Chr. erhalten10, darunter eine 142 bp lange cox1-Sequenz und ein 152 bp langes Fragment des nadh1-Gens. Während mehrere Studien über die Entdeckung antiker parasitärer DNA aus archäologischen Stätten aus der Eisenzeit und später berichten31,32,33,34,35, gibt es weltweit nur eine begrenzte Anzahl von Berichten über Überreste von Darmwürmern aus der Bronzezeit, und sogar noch weniger mit molekularen Daten. In einer aktuellen Studie wurden Eier von Dibothriocephalus sp., Trichuris sp., Dioctophyme renale (ein Hundeparasit, der nur sehr selten Menschen befällt), Echinostoma sp. und Capillaria sp. wurden durch digitale Lichtmikroskopie in Koprolithen einer Mostfarm aus der Spätbronzezeit in Feuchtgebieten in England, Großbritannien, nachgewiesen36. Auf der Insel Kea, Griechenland, werden Eier von Ascaris sp. und Trichuris sp. wurden in Bodensedimentproben aus dem Kreuzbein- und Darmbeinbereich von Bestattungen aus der Jungsteinzeit bis zur byzantinischen Zeit nachgewiesen37. Auf Sardinien, Italien, wurden Eier von Ascaris und Trichuris in bronzezeitlichen Gruben und Brunnen gefunden38. Frühere Studien an bronzezeitlichen Proben aus Europa umfassen Funde von Ascaris, Trichuris, Ancylostoma duodenale (einem der beiden menschlichen Hakenwürmer) und Dicrocoelium dendriticum (dem Lanzettenleberegel)39,40,41. Außerhalb Europas wurden Parasiteneier aus archäologischen Ausgrabungen aus der Bronzezeit gemeldet, insbesondere auch aus dem Iran42,43,44. Bei einer Bestattung eines bronzezeitlichen Friedhofs (2600–2200 v. Chr.) wurden Eier von D. dendriticum gefunden, die den ältesten Fund dieses Parasiten im Nahen Osten darstellen42. Funde von D. dendriticum-Eiern im menschlichen Kot weisen auf eine enge Beziehung zwischen Menschen und Pflanzenfressern hin, da der Lebenszyklus dieses Parasiten Schafe, Schnecken und Ameisen umfasst. In Tel Meggido, Israel, wurde bei mikroskopischen Untersuchungen von Fäkalienmaterial, das in der Nähe der Überreste eines großen Palastes aus der Spätbronzezeit gefunden wurde, ein schlecht erhaltenes Trichuris-Ei entdeckt45. Alle diese Daten wurden jedoch nur durch Mikroskopie gewonnen. In Sedimentproben aus der neolithischen (5320–4980 v. Chr.) Seeufersiedlung La Draga in Spanien wurde DNA von Ascaris sp., T. trichiura, E. vermicularis, T. saginata und D. dendriticum durch Multiplex-PCR nachgewiesen. Wiederum waren zwei Taxa (D. dendriticum und E. vermicularis) mikroskopisch nicht nachweisbar, wobei jedoch auch Dibothriocephalus sp., Capillaria sp., Paramphistomum sp. (Parasit von Wiederkäuern) und Macracanthorhynchus sp. (tierischer Parasit, der hauptsächlich Schweine und Wildschweine befällt)30. Im Jahr 2018 wurden Eier von Toxascaris sp. wurden in einem Säugetier-Fleischfresser-Koprolithen aus einer archäologischen Stätte in Argentinien aus der Zeit zwischen 14.981 und 14.552 v. Chr. entdeckt. Dies wurde durch eine alte mitochondriale DNA-Analyse bestätigt, die die Parasiteneier als Toxascaris leonina identifizierte, einen Parasiten von Hunden, Katzen und anderen Fleischfressern, der auch Menschen befallen kann Dies stellt den ältesten molekularen Nachweis eines Parasiten weltweit dar46.

Die Einschränkungen dieser Studie bestanden darin, dass der Probensatz vergleichsweise klein war und nur 35 Koprolithen umfasste. Außerdem wurden die Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten gesammelt und unterschiedlich lange gelagert. Darüber hinaus wurde in dieser Studie nur versucht, die aDNA derjenigen Parasiten zu amplifizieren, deren Eier mikroskopisch nachgewiesen wurden. Derzeit verfügbare molekulare Daten ermöglichen keine zuverlässige Unterscheidung zwischen A. lumbricoides und A. suum und legen eher nahe, dass Ascaris, das Menschen infiziert, ein Artenkomplex ist47,48, wir haben uns daher durchgehend auf den Artenkomplex A. lumbricoides bezogen.

Zusammenfassend präsentiert diese Studie die ersten erfolgreich amplifizierten und sequenzierten antiken Ascaris-DNA-Sequenzen aus der Bronzezeit sowie die ersten mikroskopischen Aufnahmen von Darmwurmeiern aus der Bronzezeit in Österreich. Darüber hinaus wurden mehrere Sequenzen verschiedener Gene des A. lumbricoides-Artenkomplexes aus Koprolithen aus der Eisenzeit gewonnen. Mikroskopisch wurden Ascaris und Trichuris in 91 % der paläofäkalen Proben nachgewiesen, was auf eine hohe Häufigkeit dieser Parasiten in zumindest einem Teil der prähistorischen Population hinweist. Interessanterweise wurden jedoch nur diese beiden Parasitenarten gefunden.

Alle Sequenzdaten wurden an GenBank übermittelt und sind unter den folgenden Zugangsnummern verfügbar: OQ721964-OQ721974 (cox1), OQ626561-OQ626564 (cytB), OQ626565-OQ626569 (nadh1). Einzelheiten zu den methodischen Vorgehensweisen finden Sie in der aus dieser Arbeit hervorgehenden Masterarbeit49. Alle weiteren generierten Daten sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.

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Die Autoren danken dem Team des Labors für Molekulare Parasitologie am Institut für Spezifische Prophylaxe und Tropenmedizin der Medizinischen Universität Wien für Hilfe und Beratung.

Institut für Spezifische Prophylaxe und Tropenmedizin, Medizinische Universität Wien, Wien, Österreich

Elisabeth Barsch, Katharina Rodler & Julia Walochnik

Prähistorische Abteilung, Naturhistorisches Museum Wien, Wien, Österreich

Kerstin Kowarik & Hans Reschreiter

3. Zoologische Abteilung, Naturhistorisches Museum Wien, Wien, Österreich

Christoph Hörweg & Helmut Sattmann

Österreichisches Archäologisches Institut, Österreichische Akademie der Wissenschaften, Wien, Österreich

Kerstin Kowarik

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KK, HR, HS und JW: Studiendesign. EB, KK, KR, HR und JW: Probenahme. EB, KR, CH und HS: Laborarbeit und Fotografie. EB, KK und JW: Datenanalyse. EB, KK und JW: Verfassen des Manuskripts. Alle Autoren: Überprüfung und Genehmigung der endgültigen Fassung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Julia Walochnik.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Barsch, E., Kowarik, K., Rodler, K. et al. Erste molekulare Daten zum menschlichen Spulwurm-Artenkomplex Ascaris lumbricoides aus der Bronze- und Eisenzeit in Hallstatt, Österreich. Sci Rep 13, 12055 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38989-8

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Eingegangen: 31. März 2023

Angenommen: 18. Juli 2023

Veröffentlicht: 25. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38989-8

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